مطالعه اثر حذف مارپیچ 5? از لیپاز bacillus thermocatenulatus بر خصوصیات آنزیم

چکیده لیپازها (تری آسیل گلیسرول آسیل هیدرولاز (ec 3.1.1.3 از مهم ترین آنزیم های صنعتی هستند که در صنایع مختلف از جمله صنایع غذایی، شوینده ها، تولیدات دارویی، چرم، پارچه، لوازم آرایشی و کاغذ کاربرد دارند. لیپازهای باکتریایی عضوی از خانواده ?/? هیدرولاز هستند که تری آسیل گلیسیرول ها را در فاز بین آب- چربی هیدرولیز می کنند. مقایسه ساختار لیپازهای bacillus با ?/? هیدرولازها نشان می دهد که مارپیچ ?5 طی تکامل وارد ساختار لیپازهای bacillus شده است. بهبود ویژگی سوبسترایی و فعالیت کاتالیتیک لیپازها با استفاده از روش های مهندسی پروتئین در کاربردهای تجاری اهمیت دارد. در این تحقیق پس از مطالعات بیوانفورماتیک، مارپیچ ?5 از ژن btl2 باکتری bacillus thermocatenulatus با روش soe-pcr حذف و ژن جهش یافته در ta وکتور همسانه سازی و سپس درون باکتری e.coli ترانسفورم شد. پس از تایید همسانه سازی، ژن btl2 جهش یافته برای انتقال به مخمر pichia pastoris درون وکتور بیانی ppicz?b همسانه سازی شد. پس از تایید بیان، فعالیت آنزیمی پروتئین خالص شده با رزین de52 با دستگاه ph-stat سنجیده شد. پس از آن اثر سوبستراها، دما، پایداری دمایی، ph، یون فلزی، دترجنت و حلال های آلی متفاوت بر آنزیم طبیعی و جهش یافته بررسی شد. نتایج نشان داد که لیپاز جهش یافته فعالیت بالاتر در طیف وسیعتری از ph نسبت به لیپاز طبیعی دارد. همچنین افزایش فعالیت آنزیم جهش یافته در مقابل اکثر سوبستراها و به ویژه سوبسترای هشت کربنه، مشاهده شد. لیپاز جهش یافته دماهای 45 تا 60 درجه سانتیگراد را بهتر تحمل می کند که این ویژگی ها منجر به کاربردهای مختلف در صنایع شوینده، غذایی و اولئوکمیکال می گردد. به علاوه نتایج نشان داد که فعالیت آنزیم جهش یافته نسبت به آنزیم طبیعی در مقابل حلال های آلی و دترجنت های مختلف و نیز برخی یون ها از خود کاهش نشان داد. پایداری دمایی آنزیم جهش یافته نسبت به آنزیم طبیعی تغییر محسوسی نداشت. احتمال می رود که در اثر حذف مارپیچ ?5، مولکول های هیدروفوبیک کمتر در معرض سطح قرار گرفته باشند و آنزیم در مواردی افزایش فعالیت از خود نشان داده است. به علاوه حدس زده می شود که جهش، جایگاه فعال آنزیم جهش یافته را تغییر داده باشد و توانایی هیدرولیز سوبستراهای با طول زنجیر هیدروکربنی بیشتر را ایجاد کرده باشد. در کل نتایج آزمایشات ثابت کرد که مارپیچ ?5 در ساختار لیپاز bacillus thermocatenulatus ضروری نبوده و حذف آن تاخوردگی کلی آنزیم را از بین نمی برد، به علاوه در مواردی باعث افزایش فعالیت نیز می-گردد که منجر به کاربردهای بیشتر این آنزیم در صنایع مختلف می شود. واژگان کلیدی: لیپاز، مهندسی پروتئین، مارپیچ ?5، ?/? هیدرولازها، bacilus thermocatenulatus، pichia pastoris